Trabalho de Conclusão de Curso

Documento

Autoria

Gyuricza, Isabela Gerdes

Unidade da USP

Data de Apresentação

Orientador

Haddad, Simone Kashima
Pereira, Tathiane Maistro Malta

Banca

Haddad, Simone Kashima (Presidente)
Covas, Dimas Tadeu
Castelo, Ademilson Panunto

Título em Português

Caracterização molecular e funcional de células-tronco de pluripotência induzida (iPS)

Palavras-chave em Português

Células-tronco embrionárias (CTE)
Células-tronco de pluripotência induzida (iPS)
Pluripotência
Expressão gênica
Imunofenotipagem
Corpos embrioides
Teratoma

Resumo em Português

A descrição das células-tronco de pluripotência induzida (iPS) representou um grande avanço na medicina regenerativa e terapia celular, apresentando-se como uma alternativa ao uso das células-tronco embrionárias humanas (hCTE). O objetivo deste trabalho foi caracterizar as linhagens de iPS geradas em nosso laboratório no período de janeiro de 2013 a julho de 2015. Destas linhagens, uma foi modificada com os genes OCT4, SOX2, KLF4 e c-MYC, a qual recebeu o nome de iPS_BM_03, cujos clones estudados foram: Clone 03 (iPS_Cl_03), Clone 04 (iPS_Cl_04), Clone 08 (iPS_Cl_08) e Clone 11 (iPS_Cl_11). Outras duas linhagens foram modificadas com o gene TCL1: BJ_TCL1 e CCD_TCL1. As iPS_Cl_11, BJ_TCL1 e CCD_TCL1 foram analisadas quanto à expressão dos genes OCT4, SOX2, NANOG, KLF4 e c-MYC por meio de PCR quantitativo em tempo real (qPCR). As linhagens apresentaram alta expressão dos genes de pluripotência quando comparadas a células diferenciadas (fibroblastos). Foi realizada a imunofenotipagem das células iPS_Cl_11, iPS_Cl_08, BJ_TCL1 e CCD_TCL1 para marcadores de pluripotência intracelulares (como OCT4 e NANOG) e de superfície (SSEA-4). As células foram positivas para todos os marcadores intracelulares, com exceção das linhagens BJ_TCL1 e CCD_TCL1 que não apresentaram marcação de OCT4. Além disso, não houve marcação significativa de SSEA-4 para nenhuma das linhagens. Para a análise do potencial de diferenciação das linhagens em células dos três folhetos embrionários foi realizado o ensaio de formação de corpos embrioides (CE) com os clones iPS_Cl_03 e iPS_Cl_04. Ambas as linhagens avaliadas demonstraram formação de CE. Os CE da iPS_Cl_03 foram analisados por imunofluorescência e demonstraram expressão de marcadores dos três folhetos embrionários. As células iPS_Cl_08, iPS_Cl_11, BJ_TCL1 e CCD_TCL1 foram submetidas ao ensaio de diferenciação in vivo (formação de teratoma). Neste ensaio, foram obtidos tumores apenas de BJ_TCL1, os quais foram extraídos, processados histologicamente, corados com hematoxilina-eosina (H&E) e analisados por imunohistoquímica. As análises evidenciaram características malignas. Com base nestes resultados foi possível verificar a heterogeneidade das linhagens quanto às características moleculares e funcionais. Neste contexto, torna-se evidente a necessidade da completa caracterização das linhagens reprogramadas, por meio de diferentes metodologias, reforçando a importância da realização de ensaios in vivo

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Data de Publicação

2016-04-13

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