Trabalho de Conclusão de Curso

Documento

Autoria

Costa, Marcelo Vieira

Unidade da USP

Data de Apresentação

Orientador

Castelo, Ademilson Panunto

Banca

Castelo, Ademilson Panunto (Presidente)
Polizeli, Maria de Lourdes Teixeira de Moraes
Annichini, Maria Sol Brassesco

Título em Português

Determinação de carga fúngica em órgãos de camundongos infectados com Paracoccidioides brasiliensis por reação em cadeia da polimerase quantitativa

Palavras-chave em Português

Reação em cadeia da polimerase
PCR em tempo real
Paracoccidioidomicose experimental
Fungo
Infecção

Resumo em Português

Espécies de fungos dimórficos do gênero Paracoccidioides causam a paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica que é endêmica na América Latina, sendo um problema de saúde pública no Brasil, que abriga 80% dos casos. A infecção ocorre pela a inalação de propágulos micelianos, que se transformam em leveduras, a 37oC, e induzem uma inflamação crônico-granulomatosa, sendo o pulmão o órgão mais afetado. Uma parte significativa dos conhecimentos sobre a PCM advém de estudos em modelo experimental em camundongos. Por desenvolver uma patologia similar à PCM humana, o modelo murino é amplamente usado, possibilitando o desenvolvimento de diversos protocolos experimentais, tais como os de vacinas e terapias. Embora o método clássico para quantificação da carga fúngica por unidades formadoras de colônias (UFC) em cultura microbiana seja amplamente usado nos estudos de PCM experimental, em outros modelos de infecção se verifica uma forte tendência à inclusão de métodos moleculares para complementar ou substituir os métodos clássicos, tal como a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR). Este trabalho visou a padronização da metodologia de qPCR para a quantificação de DNA genômico de P. brasiliensis obtido do pulmão de camundongos infectados, através do gene de uma glicoproteína gênero-específica de 43kDa (gp43). Para tanto, grupos de camundongos infectados tiveram seus pulmões extraídos, macerados e submetidos à PCR, nested-PCR e qPCR. O baixo nível de detecção de amplicons em todas as situações ensaiadas sugeriu que um baixo número de cópias do gene alvo era encontrado no DNA extraído diretamente do macerado de pulmão. Buscamos, então, isolar os fungos dos pulmões antes da extração de DNA, pelo método fenol:clorofórmio, através da lise das células murinas com água, filtração para eliminação de matriz extracelular e fibras do órgão, seguido por lavagem das leveduras. Com esse protocolo de isolamento de fungo do órgão foi possível estabelecer um coeficiente de determinação muito alto (R2 ~ 0,9) entre o número de cópias do gene de gp43 e o número de UFCs obtidos do pulmão. Esses resultados demonstram que essa técnica é robusta e relativamente rápida e fácil de ser realizada, sendo aplicável aos modelos de PCM experimental murina

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Data de Publicação

2016-04-13

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