Clonagem, expressão e purificação das proteínas recombinantes GP120 e GP41 do...

O HIV, Vírus da Imunodeficiência Humana, é o retrovírus causador da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS). É um vírus linfotrópico com preferência principalmente para linfócitos T CD4+. Ao infectar tais células, o HIV causa imunocomprometimento no indivíduo, o que favorece o surgimento de doenças oportunistas em uma fase mais avançada da infecção. Os primeiros anticorpos a serem produzidos na infecção por HIV são da classe IgM contra a proteína gp41, produzidos cerca de 13 dias após a detecção do RNA viral no plasma. Outra proteína que é um importante alvo de anticorpos é a glicoproteína gp120, detectada a partir de 28º dia após a detecção de RNA viral. Segundo a UNAIDS, estima-se que em 2016 havia cerca de 36,7 milhões de pessoas vivendo com HIV/AIDS no mundo, sendo no Brasil, no mesmo ano, aproximadamente 830.000. Sendo assim, a infecção por HIV é vista hoje como um dos grandes problemas de saúde pública, principalmente porque sua incidência vem aumentando nos últimos anos. O diagnóstico precoce para infecção por HIV é fundamental para que ocorra o tratamento dos indivíduos e o controle da epidemia, diminuindo assim as chances de disseminação do vírus. Dessa forma, é importante que os testes diagnósticos rápidos sejam continuamente melhorados a fim de que sejam amplamente disponíveis. Em vista disso, o objetivo do presente estudo foi produzir as proteínas recombinantes gp41 e gp120 do HIV-1 através da tecnologia do DNA recombinante para serem empregadas futuramente em teste diagnóstico. Inicialmente foi escolhido o sistema de expressão procarioto E. coli. Porém, não obteve-se sucesso com a expressão das proteínas em BL21(DE3)pLYSs, pois foi observado uma grande quantidade de códons raros nas sequências. Desse modo, foi trocada a linhagem bacteriana para Rosetta(DE3), pois esta linhagem codifica os códons raros. Entretanto, também não foi possível obter a expressão das proteínas. Como alternativa, foi trocado o sistema de expressão procarioto para o sistema eucarioto Pichia pastoris. O gene das proteínas de interesse foram clonados no vetor pPICZ?A e foi feito o teste de expressão em menor escala (screening) para identificação da colônia mais produtora. Após a indução em menor escala foi realizado a purificação do sobrenadante de uma colônia escolhida para cada proteína em cromatografia de afinidade a níquel. Por fim, as proteínas foram identificadas por dot blotting. Com os resultados obtidos até o momento a produção das proteínas gp41 e gp120 do HIV-1 mostra-se promissora em Pichia pastoris

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Data de Publicação

2019-08-20

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